自2013年歐盟全面禁止化妝品動物實驗以來新的力量，體外重建皮膚模型已廣泛應(yīng)用于藥物和化妝品功效研究及毒理評價先進水平。然而，現(xiàn)有的體外皮膚模型在模擬皮膚功能方面去創新，尤其在血管化重建方面足夠的實力，仍存在顯著不足，這導(dǎo)致難以實現(xiàn)組織區(qū)域的有效灌注學習。

摩方精密圣地亞哥研究院團(tuán)隊開發(fā)了一種全新的三維可灌注血管化皮膚芯片，采用了摩方精密的面投影微立體光刻（PμSL）技術(shù)聽得懂，精確構(gòu)建仿生微毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)應用優勢。該皮膚芯片在營養(yǎng)供給、增強(qiáng)屏障功能和維持組織活性方面表現(xiàn)優(yōu)異全方位，與傳統(tǒng)的內(nèi)皮細(xì)胞自組裝或犧牲材料方法相比高效節能，該模型簡化了操作流程并提高了實驗的可重復(fù)性。通過石蠟切片大局、蘇木精-伊紅（H&E）染色和免疫熒光標(biāo)記方法新創新即將到來，驗證了芯片中的真皮層和表皮層的完整結(jié)構(gòu)。

這一研究成果以“Full-Thickness Perfused Skin-on-a-Chip with In Vivo-Like Drug Response for Drug and Cosmetics Testing "為題有序推進，發(fā)表在《Bioengineering》上設施。摩方精密圣地亞哥研究院的Stephen Rhee為論文第一作者，孫冰潔博士為通訊作者堅定不移。

此外組合運用，該芯片支持高通量測試，其定制化夾具支持在多孔板中同時進(jìn)行多個芯片的灌注實驗迎難而上。通過使用TNF-α誘導(dǎo)炎癥及地塞米松的抗炎治療積極，摩方研究團(tuán)隊將該芯片與傳統(tǒng)2D培養(yǎng)和人類皮膚活檢樣本進(jìn)行了對比。結(jié)果表明堅持先行，皮膚芯片與人類皮膚的藥物反應(yīng)趨勢一致產業，且在長期培養(yǎng)中表現(xiàn)出更低的細(xì)胞毒性。

這一灌注皮膚芯片為藥物和化妝品篩選提供了一個高度仿生的體外模型情況較常見，顯著提高了實驗的生理相關(guān)性可持續。

01

精密3D打印與微流控設(shè)計

還原真實血管化全層皮膚環(huán)境

通過PμSL 3D打印技術(shù)（microArch® S230，精度：2微米）機製，摩方研究團(tuán)隊成功地在芯片中構(gòu)建了仿生微毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)全過程。該系統(tǒng)中，每個中空的微通道表面均勻分布有7微米的開放微孔探討，微通道內(nèi)可以灌輸細(xì)胞培養(yǎng)基不負眾望，使得營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣能夠從通道內(nèi)均勻擴(kuò)散至管道外的細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)域高效流通。同時，灌輸系統(tǒng)可有效排出代謝廢物精準調控，從而確保細(xì)胞的健康生長和組織的長期活性功能。微通道貫穿整個皮膚組織，保證了培養(yǎng)基在組織內(nèi)的均勻供給體系。

為了提高皮膚芯片的功能性和操作便捷性生產製造，摩方研究團(tuán)隊設(shè)計了定制化芯片夾具，確保皮膚芯片能夠精確放置攜手共進，并與標(biāo)準(zhǔn)的6孔板兼容共同。夾具蓋的設(shè)計可提供穩(wěn)定的氣液界面，這對于皮膚模型的全面仿生功能化至關(guān)重要經過。（圖1展示了皮膚芯片與夾具的設(shè)計細(xì)節(jié)簡單化，圖2展示了灌注系統(tǒng)的設(shè)置和操作流程。）

圖1. 皮膚芯片與夾具示意圖明確了方向。(a系統性，b) 皮膚芯片的俯視圖與正視圖，顯示微通道的布局及內(nèi)部結(jié)構(gòu)單產提升；(c) 微孔的掃描電鏡（SEM）圖像傳遞，比例尺：200微米；(d) 放大后的SEM圖像勞動精神，展示單個微孔開展攻關合作，比例尺：20微米；(e) 皮膚芯片與夾具組裝前的圖像保供；(f) 皮膚芯片裝入夾具后的側(cè)視圖自行開發；(g) 六個皮膚芯片及夾具放置于六孔板中的圖像。

圖2. 皮膚芯片灌注系統(tǒng)的設(shè)置與操作流程責任，通過簡單的三步流程即可輕松實現(xiàn)穩(wěn)定灌注應用情況。(1) 將皮膚芯片放入夾具中；(2) 將夾具插入六孔板并固定蓋子組建；(3) 連接灌注系統(tǒng)的入口和出口端口并啟動灌注表現。灌注系統(tǒng)通過管道連接入口與出口，入口管道連接裝有培養(yǎng)基的注射器深刻變革，并與雙向注射泵相連結論；出口管道連接空注射器以收集廢液，同樣連接到雙向注射泵質生產力。

02

灌注監(jiān)測流體情況

營養(yǎng)供給和小分子吸收測試

研究團(tuán)隊使用熒光小分子溶液進(jìn)行灌注測試適應性強，監(jiān)測流體在芯片中的流動與擴(kuò)散情況。熒光溶液以10微升/分鐘的速度注入微通道先進的解決方案，熒光分子均勻擴(kuò)散并充滿芯片拓展，整塊芯片中的熒光強(qiáng)度隨之而逐漸增加（圖3a-b）資源配置。雖然PDMS常用于傳統(tǒng)器官芯片系統(tǒng)，但其對小分子的吸收會影響藥物測試的準(zhǔn)確性相關。因此大力發展，研究團(tuán)隊對芯片使用的BIO材料進(jìn)行了小分子藥物的吸收測試，將五種FDA批準(zhǔn)的小分子藥物與BIO材料孵育24小時并和對照組對比生產效率，通過高效液相色譜法（HPLC）進(jìn)行分析產能提升。結(jié)果表明，BIO材料中的藥物濃度與對照組無顯著差異節點，證明該材料不會吸收小分子（圖3c）通過活化。

圖3. 皮膚芯片系統(tǒng)中小分子擴(kuò)散與吸收的驗證(a) 灌注后微通道中熒光小分子擴(kuò)散到芯片中的時間序列圖像，比例尺：1毫米的特點；(b) 灌注后芯片內(nèi)熒光強(qiáng)度的變化圖研學體驗；(c) 孵育BIO材料24小時后藥物溶液中小分子藥物的濃度。

03

仿真人類皮膚組織的構(gòu)建

灌注系統(tǒng)應(yīng)用及形態(tài)分析

為了模擬體內(nèi)皮膚環(huán)境最為突出，研究團(tuán)隊在皮膚芯片上成功重建了表皮層和真皮層。真皮層由成纖維細(xì)胞與I型膠原蛋白水凝膠構(gòu)成相結合，表皮層則由種植在真皮層上的角質(zhì)形成細(xì)胞組成高效化。真皮層被種植在微通道周圍，確保灌注系統(tǒng)能夠有效地為皮膚組織提供營養(yǎng)供應(yīng)為產業發展。石蠟切片與蘇木精-伊紅（H&E）染色結(jié)果顯示範圍和領域，本研究構(gòu)建的皮膚模型具有清晰的表皮和真皮結(jié)構(gòu)，且角質(zhì)形成細(xì)胞向真皮層的遷移極少（圖4）各項要求。

通過免疫染色更高要求，研究團(tuán)隊使用共聚焦顯微鏡確認(rèn)了皮膚模型的組織形態(tài)。表皮層中角蛋白10（CK10）的表達(dá)和基底層中角蛋白14（CK14）的表達(dá)驗證了表皮層的均勻性和結(jié)構(gòu)完整性（圖5a）新技術。此外共同學習，真皮層中的成纖維細(xì)胞形態(tài)以及I型和IV型膠原蛋白的表達(dá)也得到了清晰的展示（圖5b, c）。表皮層還觀察到了分化標(biāo)記物外皮蛋白（involucrin）和絲聚合蛋白(filaggrin)的表達(dá)（圖5d, e）深入。

圖4. 皮膚芯片中皮膚組織結(jié)構(gòu)及形成的示意圖效高。(a) 體內(nèi)皮膚結(jié)構(gòu)與芯片皮膚結(jié)構(gòu)的對比，角質(zhì)形成細(xì)胞基礎、真皮成纖維細(xì)胞的位置以及營養(yǎng)物質(zhì)性能、廢物和藥物的傳輸。右側(cè)為皮膚芯片組織切片的蘇木精-伊紅（H&E）染色圖像對外開放，比例尺：75微米技術創新；(b) 皮膚芯片中，從真皮形成到表皮形成的過程示意圖探索創新。

圖5. 免疫熒光圖像顯示皮膚構(gòu)建中表皮層和真皮層的存在帶來全新智能。(a) 表皮層的橫截面實現了超越，顯示角蛋白10和角蛋白14的表達(dá)；(b更優質，c) 真皮層的底部視圖相對開放，顯示I型膠原蛋白和IV型膠原蛋白的表達(dá)；(d脫穎而出，e) 表皮層的橫截面拓展應用，顯示外皮蛋白（involucrin）的表達(dá)和絲聚合蛋白（filaggrin）的表達(dá)，比例尺：75微米結構。

04

關(guān)鍵應(yīng)用與實驗結(jié)果

皮膚芯片在藥物測試中的應(yīng)用

炎癥是最常見的皮膚疾病之一管理，影響約25%的人口。為測試皮膚芯片構(gòu)建炎癥模型并用于藥物檢測的有效性能力建設，研究團(tuán)隊通過使用促炎細(xì)胞因子TNF-α在芯片中誘導(dǎo)炎癥模樣，并使用抗炎藥物地塞米松進(jìn)行治療。地塞米松作為FDA批準(zhǔn)的抗炎藥物服務，能夠有效緩解紅腫很重要、發(fā)熱及疼痛。

實驗設(shè)置了三種條件：對照組覆蓋、炎癥組和炎癥+藥物組異常狀況。對照組使用空白培養(yǎng)基；炎癥組于第二天加入TNF-α高效，24小時后更換為空白培養(yǎng)基應用創新；炎癥+藥物組于第二天加入TNF-α，24小時后更換為地塞米松機構。研究團(tuán)隊分別在各個關(guān)鍵時間點收集上清液的特性，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6（IL-6）和白細(xì)胞介素-8（IL-8）的表達(dá)。

為驗證皮膚芯片的準(zhǔn)確藥物響應(yīng)基礎，研究團(tuán)隊還與2D培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞和人類皮膚活檢樣本的藥物響應(yīng)情況進(jìn)行了對比提供堅實支撐。2D培養(yǎng)模型對炎癥和地塞米松的敏感性較高，在加入TNF-α后24小時內(nèi)炎癥急劇上升經過，TNF-α去除后炎癥立即下降簡單化，而地塞米松的加入更加顯著地降低了IL-6和IL-8的水平。相比之下明確了方向，人類皮膚活檢樣本的反應(yīng)較慢設計，TNF-α誘導(dǎo)24小時后炎癥水平上升幅度較小，而在第三天去除TNF-α并換成空白培養(yǎng)基后改進措施，炎癥組的炎癥水平卻持續(xù)上升就此掀開；與此同時，炎癥+藥物組的炎癥水平在第三天加入地塞米松后得到了有效控制。通過對比穩步前行，皮膚芯片與人類皮膚活檢的藥物響應(yīng)結(jié)果相似結構不合理，在TNF-α誘導(dǎo)的過程中顯示出了相對于2D 培養(yǎng)的延遲炎癥反應(yīng)，且在加入地塞米松后炎癥水平得到了有效控制（圖6）逐步改善。

比較三種培養(yǎng)模型的整體趨勢意見征詢，人類皮膚活檢樣本與我們的皮膚芯片顯示了相似的炎癥和地塞米松治療模式，而2D培養(yǎng)模型則表現(xiàn)出更為劇烈的炎癥波動大大提高，形成了顯著不同的藥物響應(yīng)趨勢的必然要求。這表明，皮膚芯片模型能夠更準(zhǔn)確地預(yù)測體內(nèi)反應(yīng)取得了一定進展，從而提高藥物效力與安全性評估的可靠性完善好。

圖6. 不同培養(yǎng)條件下的相對細(xì)胞因子水平變化。在3天的炎癥誘導(dǎo)和藥物處理后檢測不同培養(yǎng)條件下的細(xì)胞因子水平：(a, b) 2D培養(yǎng)模型中的相對IL-6和IL-8水平變化積極參與；(c, d) 人類皮膚活檢樣本中的相對IL-6和IL-8水平變化問題分析；(e, f) 皮膚芯片中的相對IL-6和IL-8水平變化；Control:對照組交流研討；TNF-α：僅炎癥組更加完善；TNF-α + Dex：炎癥+藥物組。

05

長時間培養(yǎng)的細(xì)胞穩(wěn)定性

實現(xiàn)靈活與高性能生產(chǎn)兼顧

皮膚活檢樣本在細(xì)胞活性和可培養(yǎng)時間上存在較大的批次差異建設應用。為評估長期培養(yǎng)中的細(xì)胞活性資源配置，研究團(tuán)隊檢測了皮膚芯片、2D培養(yǎng)及人類皮膚活檢樣本上清液中乳酸脫氫酶（LDH）的表達(dá)水平相關。LDH是檢測細(xì)胞損傷或死亡的關(guān)鍵指標(biāo)，LDH水平上升通常表明細(xì)胞活性下降或細(xì)胞受損豐富內涵。

在2D模型中生產效率，LDH水平在培養(yǎng)24小時后有所上升，48小時后略有下降適應性。而人類皮膚活檢樣本的LDH水平逐日遞增節點，培養(yǎng)48小時后幾乎達(dá)到初始水平的3倍之多。相比之下發展成就，皮膚芯片展示出了明顯的優(yōu)勢成就，其LDH水平在培養(yǎng)24小時后保持穩(wěn)定，并在培養(yǎng)48小時后顯著下降開展面對面，顯示出較好的細(xì)胞穩(wěn)定性和長期培養(yǎng)潛力（圖7）系統，因此在長期實驗中更具適用性。

圖7. 在3天培養(yǎng)過程中進一步提升，不同模型中乳酸脫氫酶（LDH）的表達(dá)水平變化空間廣闊。(a,b) 2D單層培養(yǎng)中LDH的表達(dá)水平變化；(c,d) 人類皮膚活檢樣本中LDH的表達(dá)水平變化；(e,f) 皮膚芯片中的LDH的表達(dá)水平變化知識和技能，LDH水平上升表明細(xì)胞活性下降或細(xì)胞受損取得顯著成效。

06

發(fā)展與期望

摩方持續(xù)推動終端應(yīng)用發(fā)展

本研究開發(fā)的皮膚芯片結(jié)合了摩方精密的高精度3D打印技術(shù)與微流控系統(tǒng)，為藥物與化妝品篩選提供了一個高度準(zhǔn)確且具有生理相關(guān)性的體外模型實現。因此不容忽視，該皮膚芯片通過與更多種類的藥物和活性化合物相結(jié)合，有望為未來的生物醫(yī)藥和化妝品研究提供更多可能性服務體系。

總體而言說服力，該皮膚芯片的開發(fā)標(biāo)志著組織工程與藥物測試技術(shù)的重大進(jìn)展。通過提供一個更精準(zhǔn)且用戶友好的模型問題，使得摩方精密可以實現(xiàn)模擬人類皮膚的真實反應(yīng)逐漸顯現，并在皮膚科、藥理學(xué)及化妝品研究中展現(xiàn)出巨大潛力系統穩定性。未來的研究將進(jìn)一步整合更多類型的細(xì)胞拓展基地，如灌注免疫細(xì)胞，以提升模型的應(yīng)用性實力增強，并深入研究皮膚與免疫系統(tǒng)之間的相互作用體系流動性，這一進(jìn)展將有望為銀屑病、濕疹及過敏反應(yīng)等疾病的理解和治療提供新思路帶來全新智能。